Warning: include(header_rest.php): failed to open stream: No such file or directory in /home/klient.dhosting.pl/pmpcg/artnewsletter.pl/public_html/artykuly/2/Kriokonserwacja-zarodkow-niezbedny-element-procedury-zaplodnienia-pozaustrojowego.php on line 32

Warning: include(header_rest.php): failed to open stream: No such file or directory in /home/klient.dhosting.pl/pmpcg/artnewsletter.pl/public_html/artykuly/2/Kriokonserwacja-zarodkow-niezbedny-element-procedury-zaplodnienia-pozaustrojowego.php on line 32

Warning: include(): Failed opening 'header_rest.php' for inclusion (include_path='.:/usr/local/php/5.6/5.6.29-dh1/lib/php') in /home/klient.dhosting.pl/pmpcg/artnewsletter.pl/public_html/artykuly/2/Kriokonserwacja-zarodkow-niezbedny-element-procedury-zaplodnienia-pozaustrojowego.php on line 32

Kriokonserwacja zarodków – niezbędny element

procedury zapłodnienia pozaustrojowego




Autorzy:
Krzysztof Papis
Wieloletni pracownik naukowy Zakładu Embriologii Doświadczalnej IGHZ PAN w Jastrzębcu, specjalizujący się w kriokonserwacji oocytów i zarodków ssaków. Autor patentu "Metoda kriokonserwacji komórek" przyznanego w Japonii w 2000r. Od połowy lat 90-tych współpracuje z "nOvum".

Dr n. med. Katarzyna Kozioł
Specjalista ginekolog-położnik, starszy embriolog kliniczny (senior clinical embryologist ESHRE), od 1994 roku kieruje laboratorium in vitro w Przychodni Lekarskiej ”nOvum”. Członek wielu towarzystw naukowych polskich i zagranicznych PTG, PTMR, ESHRE ASRM.


Robert Edwards, twórca metody zapłodnienia pozaustrojowego i laureat nagrody Nobla z medycyny z 2010 r., jeszcze zanim doczekał się w lipcu 1978r. narodzin Luizy Brown, będąc mimo pierwszych sukcesów bez wątpienia dopiero na początku swej kariery, rozważał w środowisku kriobiologów szanse na zamrażanie ludzkich zarodków.

W styczniu 1977 uczestniczył w Londynie w sympozjum Ciba Foundation pt. „The Freezing of Mammalian Embryos” („Zamrażanie Zarodków Ssaków”), gromadzącym śmietankę ówczesnych kriobiologów (P. Mazur, S. Leibo, C. Polge) oraz embriologów zainteresowanych zamrażaniem, w tym m. in. A. Trounsona i G.H. Zeilmakera, twórców narodzin pierwszych dzieci z zamrożonych zarodków w 1983 i 1984 r w Australii i Holandii. Uczestnikiem z Polski był mgr Zdzisław Smorąg, obecnie dyrektor ds. naukowych Instytutu Zootechniki PIB w podkrakowskich Balicach. Już wówczas Edwards rozważał potrzebę zastosowania w medycynie rozrodu kriokonserwacji, zarówno przedowulacyjnych oocytów jak i (znacznie wówczas lepiej opracowanej) kriokonserwacji zarodków rozwiniętych w hodowli po zapłodnieniu in vitro. Od tamtej pory, z zarodków zamrożonych w różnym stadium przedimplantacyjnego rozwoju urodziło się na świecie kilka milionów zdrowych dzieci i niezliczone miliony innych ssaków. Pomimo tego kriokonserwacja ludzkich zarodków wciąż traktowana jest przez oponentów tej metody na równi z ich zabijaniem i budzi w niektórych krajach (również niestety w Polsce) poważne kontrowersje i obawy, a czasem niemal histeryczny sprzeciw. W oparciu o światowe piśmiennictwo, jak też na bazie własnego wieloletniego doświadczenia w realizacji programu kriokonserwacji zarodków w Przychodni „nOvum”, omówimy niektóre fakty związane z kriokonserwacją zarodków i z ich klinicznym zastosowaniem.

Początki kriokonserwacji zarodków człowieka były - przyznajmy - dość trudne. Metoda zamrażania zastosowana przez Trounsona, przewidująca użycie dimetylosul-fotlenku (DMSO) jako krioprotektanta, pozwalała na przeżycie niewiele ponad 50% zarodków. Procedura schładzania była bardzo pracochłonna i trwała wiele godzin. Początkowo spore problemy stwarzało także właściwe przygotowanie pacjentek do zabiegu transferu zamrożonych i następnie rozmrożonych zarodków (Frozen Embryo Transfer – FET). Odsetek uzyskiwanych ciąż klinicznych rzadko przekraczał 15%. Wprowadzenie francuskiej (Lasalle i Testart), zmodyfikowanej metody zamrażania z użyciem propandiolu (PROH) z dodatkiem sacharozy, pozwoliło na skrócenie procedury zamrażania (schładzania) do ok. 2 godzin, ale – co ważniejsze - podniosło ogólną efektywność kriokonserwacji. Zamrażanie przeżywało 60-70% zarodków, a odsetek ciąż uzyskiwanych w wyniku transferu zamrożonych zarodków (FET) wzrósł do przynajmniej 20%. Optymalizacja procedury zamrażania zarodków oraz przygotowania pacjentek do FET doprowadziły po kilku latach do dalszej poprawy skuteczności, wyrażonej wzrostem odsetka uzyskiwanych ciąż do ponad 25%. Taka wysoka skuteczność pozwoliła w wielu klinikach na redukcję liczby zarodków podawanych w FET. Coraz częściej zamiast dwóch lub trzech rozmrożonych zarodków (a czasem nawet większej ich liczby, co bywało dość powszechne w USA), decydowano się na transfer jednego zarodka, akceptując pewne obniżenie odsetka uzyskiwanych ciąż (na ogół do 15-17%) w celu ograniczenia do minimum występowania ciąż mnogich. Powyższe dane dotyczą zarodków zamrażanych w drugiej lub trzeciej dobie po zapłodnieniu, a więc hodowanych in vitro odpowiednio przez ok. 48 lub ok. 72 godziny. Zarodki takie uzyskują w tym czasie stadium rozwoju określane liczbą blastomerów na poziomie najczęściej 4-6 komórek po 48 godzinach i 6 - 10 komórek po ok. 72 godzinach hodowli. Wraz z rozwojem metod hodowli zarodków in vitro i wprowadzaniem coraz doskonalszych pożywek hodowlanych, pozwalających na uzyskiwanie po 5 dniach embrionów w stadium blastocysty, pojawiła się też potrzeba ich zamrażania w tym, znacznie bardziej zaawansowanym stadium rozwojowym. Zarodki, które osiągnęły stadium blastocysty uważa się za najlepiej rokujące. Transfer pojedynczej blastocysty w cyklu stymulowanym przynosił niemal dwukrotny wzrost (do 30 - 35%) odsetka uzyskiwanych ciąż. Podobnie działo się z blastocystami poddanymi zamrożeniu. Okazało się jednak, że zamrażanie blastocyst metodą powolnego schładzania (najczęściej z użyciem glicerolu i sacharozy jako środków osłaniających) jest metodą dość niestabilną. Znacznie skuteczniejsza okazała się w tym wypadku witryfikacja, która polega na bardzo szybkim (liczonym w sekundach) schłodzeniu mocno skoncentrowanego roztworu, który ulega w takich warunkach przemianie w ciało stałe z pominięciem procesu krystalizacji. Prawdziwy przełom dokonał się jednak w 2005 roku po wprowadzeniu przez Masashige Kuwayamę witryfikacji mikroobjętościowej. Zaprojektowane wówczas pierwsze specjalne, czasem bardzo wymyślne nośniki (holdery), służące do witryfikacji zarodków w ekstremalnie małej objętości (rzędu 0,2 do 0,5 µl) roztworu witryfikacyjnego pozwoliły na jeszcze szybsze ich schładzanie. Już nie sekundy, lecz ułamki sekund wystarczały do schłodzenia takiej odrobiny płynu do temperatur kriogenicznych. Osiągane tempo schładzania liczone było już nie w tysiącach lecz dziesiątkach tysięcy stopni na minutę. A efekty w postaci odsetka przeżywających taką kriokonserwację zarodków przeszły najśmielsze, zdawało się, oczekiwania. Wkrótce już nie tylko Kuwayama, ale i wiele innych klinik prezentowało wyniki przekraczające 90, a nawet 95% przeżywających zarodków. Co najważniejsze, taka znakomita skuteczność dotyczyła zarodków we wszystkich stadiach przedimplantacyjnego rozwoju. Począwszy od zygot w stadium dwóch przedjądrzy, tworzących się w 16 -18 godz. po zapłodnieniu (zarodki w takim stadium zamraża się głównie w Niemczech), poprzez zarodki 2 i 3 - dniowe, a skończywszy na blastocystach. W ślad za tą znakomitą przeżywalnością zarodków poszły też rezultaty ich transferu. Coraz częściej odsetek ciąż uzyskiwanych obecnie po FET nie odbiega od wskaźników osiąganych po transferze zarodków w cyklu stymulowanym. Co ważne, jak wynika z dotychczasowych, niezbyt jeszcze licznych statystyk, dzieci rodzące się z witryfikowanych zarodków są zdrowe. Nie pojawiły się dotychczas jakiekolwiek dane mogące wskazywać na pre- czy po-statalną szkodliwość tej metody kriokonserwacji.

Warto również zauważyć, że nieustanny postęp jest też udziałem tradycyjnych metod kriokonserwacji. Subtelne modyfikacje metod powolnego schładzania pozwalają obecnie na uzyskiwanie stabilnego, przekraczającego 90% odsetka przeżywalności zarodków zamrażanych przy użyciu DMSO. Konsekwentne stosowanie tej metody mrożenia w przychodni nOvum pozwoliło na odzyskanie w 2011 r. ponad 91% żywych dwu- i trzydniowych zarodków i uzyskanie wysokiego odsetka (33,6%) ciąż klinicznych. Również wprowadzona w Australii w 2009 r. przez Davida Edgara korekta składu roztworów krioprotekcyjnych, opartych na bazie propandiolu (PROH), pozwoliła na podniesienie odsetka żywych zarodków zamrażanych tą metodą do ponad 90%. W nOvum adaptacja tej modyfikacji pozwoliła na uzyskanie w 2011 roku 86% embrionów przeżywających tę procedurę. Ponieważ wskaźniki uzyskiwane w nOvum po witryfikacji zarodków 2 i 3-dniowych (96,3% ) oraz blastocyst (81%) są równie wysokie, a odsetek ciąż klinicznych po transferze witryfikowanych blastocyst przekracza 53%, można śmiało powiedzieć, że w chwili obecnej kliniki wspomaganego rozrodu mają do dyspozycji cały wachlarz bardzo skutecznych metod kriokonserwacji zarodków, przynoszących coraz wyższy odsetek ciąż, coraz częściej nieistotnie różny od wskaźników transferu zarodków nie poddanych kriokonserwacji. Zależnie od konkretnych klinicznych i logistycznych okoliczności kliniki mogą z powodzeniem stosować zarówno witryfikację, jak też zoptymalizowane tradycyjne procedury powolnego zamrażania.

Badania nad zdrowiem dzieci poczętych z zamrożonych embrionów przyniosły optymistyczne wyniki, nieoczekiwane zwłaszcza dla przeciwników tej metody. W lipcu 2008 roku na dorocznym zjeździe ESHRE w Amsterdamie Pinborg przedstawił wyniki analizy stanu zdrowia 1267 dzieci urodzonych w latach 1995 - 2006 po transferze zamrożonych embrionów uzyskanych metodą IVF (n=878) lub ICSI (n=310). Grupę kontrolną stanowiła grupa 17857 dzieci urodzonych po transferze zarodków niepoddanych kriokonserwacji (12158 po IVF i 5699 po ICSI). Długość trwania pojedynczej ciąży po FET była znacząco dłuższa (277,1±15 dni) niż po transferze „świeżym” (274,7±16 dni). Podobnie w grupie ciąż pojedynczych znacząco większa (o ok. 200 gram) była średnia waga urodzeniowa noworodka po transferze mrożonym (3579 ± 625 gram) niż po transferze „świeżym” (3374±659 gram). Odsetek dzieci z niską wagą urodzeniową w grupie FET był niższy (5%) niż w grupie po transferze „świeżym” (8,1%). Niższy był również odsetek przedwczesnych porodów w grupie FET (6,2%) niż w grupie po transferze zarodków nie poddanych kriokonserwacji (9,1%). Autor wysnuł konkluzję, że pojedyncze ciąże po podaniu rozmrożonych embrionów trwają znacząco dłużej, dzieci mają większą wagę urodzeniową i nie wykazują podwyższonej częstości wad z porównaniu z ciążami pochodzącymi ze świeżych transferów.

W 2010 roku w Human Reproduction S. Pelkonen opublikował największe badanie kohortowe 2293 dzieci poczętych po transferze zamrożonych zarodków (FET) w porównaniu z 4151dziećmi urodzonymi po transferze zarodków „świeżych” oraz 31946 dzieci poczętych spontanicznie. Średnia waga urodzeniowa była o 134 gramy większa w grupie FET w porównaniu z grupą dzieci poczętych po transferach „świeżych” i była porównywalna z grupą referencyjną, czyli grupą dzieci poczętych spontanicznie. Nie zaobserwowano wzrostu śmiertelności okołoporodowej w okresie niemowlęcym. Pelkonen podsumował wyniki swoich badań stwierdzeniem, że zamrażanie zarodków nie wpływa negatywnie na okres prenatalny.

Do podobnych wniosków doszła Susannah Sargeant z Centre for Reproductive and Genetic Health, London, UK. Najnowsze wyniki jej badań, zaprezentowane na corocznym zjeździe Brytyjskiego Towarzystwa Płodności w styczniu 2012 w Leeds, dowodzą, że dzieci, które przyszły na świat w wyniku stosowania metody in vitro z wykorzystaniem zamrożonych embrionów, zazwyczaj rodzą się później i ważą więcej niż dzieci urodzone po transferze „świeżych” zarodków. W przedstawionej pracy przeanalizowano parametry 384 dzieci urodzonych po transferze „świeżych” zarodków i 108, które przyszły na świat po kriotransferach. Okazało się, że dzieci z drugiej grupy ważyły średnio o 253 gram więcej i urodziły się o 0,649 tygodnia później niż dzieci z pierwszej grupy, w której stwierdzono dodatkowo 7% wyższy wskaźnik liczby dzieci z niską masą urodzeniową. Nie jest jeszcze jasne, co leży u podłoża różnic wspomnianych parametrów u dzieci z obydwu badanych grup. Jedna z hipotez tłumaczy to odmiennym stanem środowiska macicy u kobiet stymulowanych hormonalnie. Uzyskane wyniki badań i wzrastająca pewność, że procedura zamrażania zarodków jest dla nich nieszkodliwa, dadzą podstawy do transferowania pacjentkom pojedynczych embrionów i ograniczenia tym samym ilości ciąż mnogich wraz ze wszystkimi ich konsekwencjami, takimi jak ryzyko przedwczesnego porodu, poronienia czy konieczności rozwiązywania ciąży poprzez cesarskie cięcie, a także pozwolą obniżyć ryzyko rozwoju cukrzycy ciążowej, nadciśnienia tętniczego i stanu przedrzucawkowego u matek czy porażenia mózgowego u ich potomstwa. Transfer pojedynczego zarodka daje najlepszy z możliwych rezultat – pojedyncze zdrowe dziecko wraz z szansą na uzyskanie kolejnych ciąż z pozostałych zamrożonych embrionów.

Podstawy do optymizmu dają również coraz liczniejsze doniesienia o możliwości długotrwałego przechowywania zamrożonych zarodków. Donna Dowilg-Lacey w marcu 2011 doniosła (Fertil. Steril. Volume 95, Issue 3, Pages 1120.e1-1120.e3, 1 March 2011) o urodzeniu zdrowego chłopca po transferze zarodków zamrożonych w stadium dwóch przedjądrzy (2PN) przed blisko 20 laty (19 lat 7 miesięcy). Jest to udokumentowany przypadek najdłuższego przechowywania zamrożonych zarodków zakończony porodem zdrowego dziecka. Oprócz tego opublikowano doniesienia o porodach zdrowych dzieci po 13 latach, 8 latach, 8, 9 latach i 12 latach przechowywania zamrożonych embrionów. Również w Polsce mamy dane świadczące o tym, że długotrwałe przechowywanie w ciekłym azocie zamrożonych zarodków nie jest dla nich szkodliwe. W październiku 2011 roku na świat przyszła zdrowa dziewczynka poczęta dzięki zapłodnieniu in vitro dokonanym w Przychodni nOvum przed niemal 11 laty. Oprócz niej, jak dotąd, urodziło się jeszcze troje zdrowych dzieci po transferze zarodków zamrożonych w nOvum i przechowywanych w ciekłym azocie przez okres blisko dziesięciu lat.

Wszystkie powyższe dane świadczą niezbicie o tym, że stosowane obecnie metody kriokonserwacji zarodków są bardzo skuteczne i bezpieczne zarówno dla zarodków jak i dla dzieci rodzących się po kriotransferze. Nie ulega dla nas żadnej wątpliwości, że kriokonserwacja zarodków powinna pozostać nieodłączną częścią procedury zapłodnienia in vitro.

  1. Pinborg A, Loft A, Aaris Henningsen A-K, Rasmussen S, NyboeAndersen A. Infant outcome of 957 singletons born after frozen embryo replacement: The Danish National Cohort Study 1995–2006. Fertil Steril 2009 (in press). doi:10.1016/j.fertnstert.2009.05.091.
  2. S. Pelkonen, R. Koivunen, M. Gissler, S. Nuojua-Huttunen, A.-M. Suikkari, C. Hydén-Granskog, H. Martikainen, A. Tiitinen, A.-L. Hartikainen Perinatal outcome of children born after frozen and fresh embryo transfer: the Finnish cohort study 1995–2006 Hum. Reprod. (2010) 25(4): 914-923 first published online February 2, 2010 doi:10.1093/humrep/dep477
  3. The research was presented as a poster (P3) at the British Fertility Society Annual Meeting on Friday 6 January 2012 at 12:15-13:15. The proceedings from the meeting will be published in a supplement in the Human Fertility.
  4. López-Teijón Serra O, Olivares R, M, Morages M, Castello C, Alvarez JG. Delivery of a healthy baby following the transfer of embryos cryopreserved for 13 years. Reprod BioMed Online. 2006;13:821–822
  5. Go KJ, Corson SL, Batzer FR, Walters JL. Live birth from a zygote cryopreserved for 8 years. Hum Reprod. 1998;13:2970–2971
  6. Quintas CJ, Donaldson MJ, Bertolino MV, Godoy H, Pasqualini RS. Birth of a healthy baby after transfer of embryos that were cryopreserved for 8.9 years. Fertil Steril. 2002;77:1074–1076
  7. Revel A, Safran A, Laufer N, Lewin A, Reubinov BE, Simon A. Twin delivery following 12 years of human embryo cryopreservation: case report. Hum Reprod. 2004;19:328–329

Warning: include(footer.php): failed to open stream: No such file or directory in /home/klient.dhosting.pl/pmpcg/artnewsletter.pl/public_html/artykuly/2/Kriokonserwacja-zarodkow-niezbedny-element-procedury-zaplodnienia-pozaustrojowego.php on line 96

Warning: include(footer.php): failed to open stream: No such file or directory in /home/klient.dhosting.pl/pmpcg/artnewsletter.pl/public_html/artykuly/2/Kriokonserwacja-zarodkow-niezbedny-element-procedury-zaplodnienia-pozaustrojowego.php on line 96

Warning: include(): Failed opening 'footer.php' for inclusion (include_path='.:/usr/local/php/5.6/5.6.29-dh1/lib/php') in /home/klient.dhosting.pl/pmpcg/artnewsletter.pl/public_html/artykuly/2/Kriokonserwacja-zarodkow-niezbedny-element-procedury-zaplodnienia-pozaustrojowego.php on line 96