Warning: include(header_rest.php): failed to open stream: No such file or directory in /home/klient.dhosting.pl/pmpcg/artnewsletter.pl/public_html/artykuly/6/9.php on line 32

Warning: include(header_rest.php): failed to open stream: No such file or directory in /home/klient.dhosting.pl/pmpcg/artnewsletter.pl/public_html/artykuly/6/9.php on line 32

Warning: include(): Failed opening 'header_rest.php' for inclusion (include_path='.:/usr/local/php/5.6/5.6.29-dh1/lib/php') in /home/klient.dhosting.pl/pmpcg/artnewsletter.pl/public_html/artykuly/6/9.php on line 32

Porównanie dwóch metod molekularnych (nested PCR

i amplifikacji całego genomu) stosowanych podczas

preimplantacyjnej diagnostyki mutacji w genie BRCA1




Autor:
Mgr Danuta Michalska
Ukończyła Wydział Biologii na Uniwersytecie Gdańskim. Napisała pracę magisterska i badawczą we współpracy z kliniką Invicta. Ukończyła studia podyplomowe w zakresie analityki medycznej na Wydziale Farmaceutycznym Uniwersytetu Medycznego w Gdańsku.

Współpraca:
Lek. med. Kinga Jaguszewska

Mgr Patrycja Kulwikowska

Dr n. med. Joanna Liss

Mgr. Kamila Kitowska

Mgr Agata Mirecka

Prof. dr hab. n. med. Krzysztof Łukaszuk


ABSTRAKT

Diagnostyka Preimplantacyjna (PGD) stanowi obecnie alternatywę dla par obarczonych dużym ryzykiem urodzenia dziecka z chorobą genetyczną oraz kobiet w wieku powyżej 37-40 lat, starających się o dziecko. Chociaż dość powszechne jest stosowanie diagnostyki preimplantacyjnej do badania chorób o wysokiej penetracji, diagnostyka chorób o niższej penetracji i chorób ujawniających się w późniejszym wieku wciąż wywołuje wiele kontrowersji. Ponadto wciąż brakuje danych na temat skuteczności różnych technik molekularnych stosowanych w PGD. W niniejszej pracy staraliśmy się ocenić skuteczność różnych metod molekularnych stosowanych w diagnostyce preimplantacyjnej trzech najczęściej występujących mutacji w genie BRCA1 (5382insC, 185delAG oraz C61G). Materiałem do diagnostyki preimplantacyjnej mutacji w genie BRCA1 były komórki jajowe pochodzące od anonimowych dawczyń. Wszystkie analizowane komórki jajowe nie kwalifikowały się do użycia w cyklach IVF. Pozytywne kontrole dla analizowanych mutacji stanowiły linie komórkowe pochodzące z Coriell Institute for Medical Research: GM14090 (185delAG), GM14097 (C61G), GM13715 (5382insC). Powtarzalność wyników uzyskanych z analizy WGA dla mutacji 5382insC wynosiła 38%. Powtarzalność wyników uzyskanych metodą nested PCR po drugiej rundzie amplifikacji dla mutacji 5382insC i 185delAG była zmienna i wahała się między 47% a 57%. Z kolei powtarzalność wyników dla analizy mutacji C61G wynosiła 100% Uzyskane przez nas wyniki sugerują, że technika nested PCR jest bardziej czuła i specyficzna. Powtarzalność metody WGA pozostaje wątpliwa, a analiza nie gwarantuje wiarygodnych wyników. Niemniej jednak, aby wybrać najlepszą metodę analizy najczęstszych mutacji w genie BRCA1, niezbędne są dalsze badania.

Wstęp:
Diagnostyka Preimplantacyjna (PGD) stanowi obecnie alternatywę dla par obarczonych dużym ryzykiem urodzenia dziecka z chorobą genetyczną (np. mukowiscydozą, ß - talasemią, chorobą Huntingtona, dystrofią miotoniczną) oraz kobiet w wieku powyżej 37-40 lat, starających się o dziecko [1,2]. Chociaż dość powszechne jest stosowanie diagnostyki preimplantacyjnej do badania chorób o wysokiej penetracji, diagnostyka chorób o niższej penetracji i chorób ujawniających się w późnym wieku wciąż wywołuje kontrowersje. Dziedziczny rak piersi i jajnika to choroba związana z mutacjami w genie BRCA1 dziedziczona w sposób autosomalny dominujący [3,4]. Pomimo faktu, że diagnostyka preimplantacyjna coraz częściej zalecana jest nosicielom mutacji w genie BRCA1/2 starającym się o potomstwo, zakres dostępnych danych na temat skuteczności różnych technik molekularnych stosowanych podczas tego typu diagnostyki wciąż jest niewielki. Obecnie najczęściej stosowanymi metodami preimplantacyjnej diagnostyki mutacji genetycznych są nested PCR oraz amplifikacja całego genomu (WGA). Ze względu na niewielką ilość dostępnych danych, ciężko określić optymalną metodę analizy mutacji w genie BRCA1 podczas PGD. W niniejszej pracy staramy się ocenić zastosowanie różnych technik molekularnych używanych w diagnostyce preimplantacyjnej do detekcji trzech najczęściej występujących mutacji w genie BRCA1 (5382insC, 185delAG oraz C61G).

Materiały i metody:
Materiałem do diagnostyki preimplantacyjnej obejmującej analizę obecności trzech najczęściej występujących mutacji w genie BRCA1 były komórki jajowe pochodzące od anonimowych dawczyń. Wszystkie analizowane komórki jajowe znajdowały się w drugiej fazie podziału mejotycznego i nie kwalifikowały się do użycia w cyklach IVF. Grupę kontrolną stanowiły próbki krwi pobrane od zdrowych pacjentów. Analizy molekularne prowadzone były w Laboratorium Biologii Molekularnej będącym częścią Laboratorium Medycznego Invicta. Pozytywne kontrole dla analizowanych mutacji stanowiły linie komórkowe pochodzące z Coriell Institute for Medical Research: GM14090 (185delAG), GM14097 (C61G), GM13715 (5382insC). Niniejsze badanie uzyskało zgodę Komisji Bioetycznej w Olsztynie. Do izolacji materiału genetycznego z limfocytów i linii komórkowych zastosowano komercyjne zestawy odczynników (Blood Mini, A & A Biotechnology Comp. i Genomic Mini, A & A Biotechnology Comp., odpowiednio). Pomiar stężeń DNA przeprowadzono z zastosowaniem spektrofotometru GeneQuantRNA/ DNA Calculator (model 80-2103-98, Pharmacia Biotech, USA). Lizę komórek prowadzono z zastosowaniem odpowiednich buforów lizujących w optymalnych warunkach temperaturowych. Po lizie komórkowej, wyizolowany materiał genetyczny poddawany był reakcji amplifikacji z zastosowaniem odpowiednich starterów. Do weryfikacji wyników uzyskanych metodą ASA-PCR zastosowano polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP). Detekcja produktów reakcji PCR odbywała się z zastosowaniem elektroforezy na 2% żelu agarozowym. Technika WGA znalazła zastosowanie jedynie w analizie mutacji 5382insC. Wyniki analiz pozostałych mutacji z zastosowaniem tej techniki były niezadowalające. Nested PCR zastosowano w analizie DNA pochodzącego z komórki jajowej jak z limfocytów krwi obwodowej.

Wyniki
Powtarzalność wyników uzyskanych z analizy mutacji 5382insC metodą WGA wynosiła 38%. Powtarzalność wyników uzyskanych tą metodą pozostaje zatem wątpliwa, szczególnie w odniesieniu do analizowanych w niniejszym badaniu materiałów biologicznych. Powtarzalność wyników uzyskanych metodą nested PCR po drugiej rundzie amplifikacji dla mutacji 5382insC i 185delAG była zmienna i wahała się między 47% a 57%. Z kolei powtarzalność wyników mutacji C61G otrzymanych metodą nested PCR wynosiła 100% (tabela 1).

Dyskusja
Niniejsze badanie porównuje wyniki diagnostyki preimplantacyjnej otrzymane z zastosowaniem dwóch różnych metod: WGA oraz nested PCR. Uzyskane przez nas wyniki sugerują, że technika nested PCR jest bardziej czuła i specyficzna, ze względu na swój dwustopniowy charakter. Rocznie z powodu raka piersi umiera w Polsce blisko 5000 kobiet [4]. Zachorowalność na ten typ nowotworu wzrasta z wiekiem. Gen BRCA1 był pierwszym z opisanych genów odpowiedzialnych za rozwój dziedzicznego raka piersi i jajnika. Dziedziczenie mutacji w tym genie odbywa się w sposób autosomalny dominujący. Znanych jest ponad 2000 mutacji w genie BRCA1, część z nich to mutacje prowadzące do zmiany ramki odczytu, delecje, insercje oraz mutacje typu missense i nonsense. Większość z tych zmian prowadzi do przedwczesnej terminacji transkrypcji, co skutkować może powstaniem białka o mniejszej liczbie aminokwasów (około 87% wszystkich terminalnych mutacji w BRCA1). Sugeruje się, że efekt kliniczny mutacji zależy od jej pozycji w łańcuchu DNA. Mutacje w środkowym obszarze genu BRCA1 związane są ze zwiększonym ryzykiem wystąpienia nowotworu piersi, natomiast mutacje znajdujące się bliżej końca 5'tego genu związane są ze zwiększonym ryzykiem zachorowania na raka jajnika [5,6]. Warto jednak pamiętać, że mutacje w genie BRCA1 nie są czynnikiem patogennym, zwiększają jedynie ryzyko zachorowania na wyżej wymienione rodzaje nowotworów. Pomimo wielu badań przeprowadzonych w naszym kraju, wciąż brakuje danych dotyczących metodologii wykrywania mutacji w genie BRCA1 [7-12]. Tym bardziej brak jest danych pochodzących z badań preimplantacyjnych. Dlatego niniejsza praca przedstawia metodologię wykrywania trzech najczęstszych mutacji w genie BRCA1: 5382insC, 185delAG i C61G. Diagnostyka Preimplantacyjna (PGD) stanowi obecnie alternatywę dla par obarczonych dużym ryzykiem urodzenia dziecka z chorobą genetyczną (np. mukowiscydozą, ß - talasemią, chorobą Huntingtona, dystrofią miotoniczną) oraz kobiet w wieku powyżej 37-40 lat, starających się o dziecko [1,2]. Chociaż dość powszechne jest stosowanie diagnostyki preimplantacyjnej do badania chorób o wysokiej penetracji, diagnostyka chorób o niższej penetracji i chorób ujawniających się w późniejszym wieku wciąż wywołuje wiele kontrowersji. W niniejszej pracy staraliśmy się ocenić zastosowanie dwóch różnych technik molekularnych używanych w diagnostyce preimplantacyjnej: WGA i multipletowy nested PCR. Uzyskane wyniki sugerują jednak, że żadna z zastosowanych przez nas metod analizy mutacji w genie BRCA1 nie ma zadowalającej skuteczności. Główną wadą techniki WGA jest tworzenie niespecyficznych produktów. Z kolei w multipleksowym nested PCR największym wyzwaniem jest dobór odpowiednich starterów. Badania przeprowadzone przez Menon’a i Quinna pokazują szerokie zainteresowanie diagnostyką preimplantacyjną w kierunku mutacji w genie BRCA1 [13,14]. Niewątpliwie diagnostyka preimplantacyjna mutacji w tym genie akceptowana jest przez pacjentów podchodzących do cykli IVF, zwłaszcza w przypadku częstego występowania raka piersi w ich rodzinie, należy jednak pamiętać, że na decyzję o zastosowaniu tego typu diagnostyki wpływ mają również czynniki etyczne i psychologiczne. Ze względu na fakt, że mutacje w genie BRCA1 nie zawsze skutkują wystąpieniem raka piersi lub jajnika, a sama diagnostyka preimplantacyjna wciąż wzbudza sporo kontrowersji, nasze badania skierowane są głównie do nosicieli tego typu mutacji, którzy chcą zniwelować ryzyko zachorowania u swoich przyszłych dzieci.

Wnioski:
W niniejszym badaniu porównano dwie techniki stosowane w diagnostyce preimplantacyjnej: amplifikację całego genomu (WGA) oraz nested PCR. Nasze wyniki wskazują, że nested PCR jest techniką bardziej czułą i swoistą. Amplifikacja całego genomu pojedynczej komórki w tym kontekście nie daje pożądanych rezultatów. Ponadto, powtarzalność metody WGA jest relatywnie niewielka. Niewielka ilość danych dotyczących zastosowania różnych technik biologii molekularnej w preimplantacyjnej diagnostyce mutacji w genie BRCA1 również utrudnia wybór optymalnej i najlepszej metody diagnostycznej.

Literatura
1. Handyside AH, Kontogianni EH, Hardy K, Winston RM: Pregnancies from biopsied human preimplantation embryos sexed by Y-specific DNA amplification. Nature 1990, 344:768-770
2. Sermon K, Van Steirteghem A, Liebaers I: Preimplantation genetic diagnosis. Lancet 2004, 363:1633-1641.
3. Lubinski J, Gorski B, Kurzawski G, Jakubowska A, Cybulski C, Suchy J, Debniak T, Grabowska E, Lener M, Nej K: Molecular basis of inherited predispositions for tumors. Acta Biochim Pol 2002, 49:571-581
4. Nowicki A, Olszewska A, Humanska M. [Self-examination influence on breast cancer detection. Research conducted in women after breast amputation]. Ginekol Pol 2007, 78:293-298
5. Gayther SA, Harrington P, Russell P, Kharkevich G, Garkavtseva RF, Ponder BA: Frequently occurring germ-line mutations of the BRCA1 gene in ovarian cancer families from Russia. Am J Hum Genet 1997, 60:1239-1242.
6. Pharoah PD, Ponder BA: The genetics of ovarian cancer. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol 2002, 16:449-468
7. Gorski B, Jakubowska A, Huzarski T, Byrski T, Gronwald J, Grzybowska E, Mackiewicz A, Stawicka M, Bebenek M, Sorokin D, Fiszer-Maliszewska L, Hauss O, Janiszewska H, Niepsuj S, Gozdz S, Zaremba L, Posmyk M, Pluzanska M, Kilar E, Czudowska D, Wasko B, Miturski R, Kowalczyk JR, Urbanski K, Szwiec M, Koc J, Debniak B, Rozmiarek A, Debniak T, Cybulski C, et al.: A high proportion of founder BRCA1 mutations in Polish breast cancer families. Int J Cancer 2004, 110:683-686.
8. Brozek I, Cybulska C, Ratajska M, Piatkowska M, Kluska A, Balabas A, Dabrowska M, Nowakowska D, Niwinska A, Pamula-Pilat J, Tecza K, Pekala W, Rembowska J, Nowicka K, Mosor M, Januszkiewicz-Lewandowska D, Rachtan J, Grzybowska E, Nowak J, Steffen J, Limon J: Prevalence of the most frequent BRCA1 mutations in Polish population. J Appl Genet 2011, 52:325-330
9. Gorski B, Byrski T, Huzarski T, Jakubowska A, Menkiszak J, Gronwald J, Pluzanska A, Bebenek M, Fischer-Maliszewska L, Grzybowska E, Narod SA, Lubinski J: Founder mutations in the BRCA1 gene in Polish families with breast-ovarian cancer. Am J Hum Genet 2000, 66:1963-1968
10. Grzybowska E, Sieminska M, Zientek H, Kalinowska E, Michalska J, Utracka-Hutka B, Rogozinska-Szczepka J, Kazmierczak-Maciejewska M: Germline mutations in the BRCA1 gene predisposing to breast and ovarian cancers in Upper Silesia population Acta Biochim Pol 2002, 49:351-356.
11. Perkowska M, BroZek I, Wysocka B, Haraldsson K, Sandberg T, Johansson U, Sellberg G, Borg A, Limon J: BRCA1 and BRCA2 mutation analysis in breast-ovarian cancer families from northeastern Poland. Hum Mutat 2003, 21:553-554.
12. Skasko E, Paszko Z, Niwinska A, Kwiatkowska E, Kruczek A, Pienkowski T: The presence of hereditary BRCA1 gene mutations in women with familial breast or ovarian cancer and the frequency of occurrence of these tumours in their relatives. Eur J Gynaecol Oncol 2004, 25:470-474.
13. Menon U, Harper J, Sharma A, Fraser L, Burnell M, ElMasry K, Rodeck C, Jacobs I: Views of BRCA gene mutation carriers on preimplantation genetic diagnosis as a reproductive option for hereditary breast and ovarian cancer. Hum Reprod 2007, 22:1573-1577
14. Quinn GP, Vadaparampil ST, King LM, Miree CA, Friedman S: Conflict between values and technology: Perceptions of preimplantation genetic diagnosis among women at increased risk for hereditary breast and ovarian cancer. Fam Cancer 2009, 8:441-449



Warning: include(footer.php): failed to open stream: No such file or directory in /home/klient.dhosting.pl/pmpcg/artnewsletter.pl/public_html/artykuly/6/9.php on line 139

Warning: include(footer.php): failed to open stream: No such file or directory in /home/klient.dhosting.pl/pmpcg/artnewsletter.pl/public_html/artykuly/6/9.php on line 139

Warning: include(): Failed opening 'footer.php' for inclusion (include_path='.:/usr/local/php/5.6/5.6.29-dh1/lib/php') in /home/klient.dhosting.pl/pmpcg/artnewsletter.pl/public_html/artykuly/6/9.php on line 139