Warning: include(header_rest.php): failed to open stream: No such file or directory in /home/klient.dhosting.pl/pmpcg/artnewsletter.pl/public_html/artykuly/7/5.php on line 32

Warning: include(header_rest.php): failed to open stream: No such file or directory in /home/klient.dhosting.pl/pmpcg/artnewsletter.pl/public_html/artykuly/7/5.php on line 32

Warning: include(): Failed opening 'header_rest.php' for inclusion (include_path='.:/usr/local/php/5.6/5.6.29-dh1/lib/php') in /home/klient.dhosting.pl/pmpcg/artnewsletter.pl/public_html/artykuly/7/5.php on line 32

Ocena ludzkiego przedimplantacyjnego zarodka



Wybór najlepszego zarodka przy zastosowaniu systemu ciągłego obrazowania (time-lapse).

Autor:
Dr Marcos Meseguer, PhD
PhD Degree in Obstetrics and Gynecology from the University of Valencia, Spain; Design and Statistics from Universidad Autonoma de Barcelona, Spain. Był Co-Director of Andrology Laboratory at the Instituto Valenciano de Infertilidad (IVI) w latach 2000-2004. Obecnie Senior Embriologist and Scientific Supervisor in the IVF unit of IVI Valencia.


Ocena morfologiczna w wyborze zarodków stosowana jest od ponad 30 lat i ciągle pozostaje podstawowym narzędziem podczas ich oceny w procedurach zapłodnienia pozaustrojowego. Metoda ta ma jednak swoje ograniczenia, nie tylko wynikające z subiektywności oceny embriologa, ale także z samego systemu dokonywania oceny, która widzi rozwój zarodka statycznie. Aktualny system oceny opiera się na morfologicznym wyglądzie zarodków w kilku ściśle określonych punktach czasowych, które ograniczają częstość dokonywanych obserwacji i nie pozwalają określić, co dzieje się z zarodkiem w interwałach czasowych (Cruz i wsp., 2012). Ponadto należy pamiętać, że status zarodka (w tym jego ocena) może istotnie zmienić się w przeciągu kilku godzin (Meseguer i wsp., 2011, Mio i Maeda, 2008). Ograniczenia te mogą zostać przezwyciężone dzięki systemowi time–lapse, który pozwala nie tylko dokonywać oceny morfologii zarodków, ale daje informacje o dynamicznych zmianach dokonujących się podczas przedimplantacyjnego okresu rozwoju zarodka.

Kluczową zaletą technologii time-lapse jest poprawa środowiska hodowli wynikająca z braku konieczności wyciągania zarodków z inkubatora w czasie ich oceny oraz możliwość otrzymania dokładnych informacji, zarówno jakościowych jak i ilościowych. Obserwacje oparte o system time-lapse są przydatne w definiowaniu nowych lub słabo dotychczas opisanych koncepcji embriologicznych, takich jak przebieg pierwszych trzech cykli podziałowych w zarodku (Lemmeni wsp., 2008, Meseguer, Herrero, Tejera, Hilligsoe, Ramsing i Remohi, 2011, Mio i Maeda, 2008), a także w redefiniowaniu tradycyjnie stosowanych w ocenie parametrów morfologicznych, takich jak np. ocena przedjądrzy (pronuclear score) (Aguilar i wsp., 2014, Azzarelloi wsp., 2012).

Uznaje się, że najbardziej istotne badania dotyczące time-lapse zapoczątkowane zostały przez Lemmen i wsp. (Lemmen, Agerholm i Ziebe, 2008), którzy poinformowali, że zarodki dające ciążę wykazywały nie tylko znacząco wyższą synchronizację podziałów do stadium zarodka 2-blastomerowego, ale także wyższą synchronizację zmian w zakresie przedjądrzy w porównaniu do tych, które nie implantowały. Wong i wsp. (2010) sugerowali, że zarodki osiągające stadium blastocysty można przewidzieć poprzez określony timing wczesnych stadiów rozwojowych: pierwszej cytokinezy (0-33 min), interwału czasowego pomiędzy pierwszą i drugą mitozą (7,8-14,3 h) oraz drugą i trzecią (0-5,8 h).

Ostatecznie stwierdzili, że w zarodkach, które nie tworzą blastocysty, rzadziej dochodzi do cofnięcia się fragmentacji, co ma miejsce w tych przypadkach, gdzie wytwarza się blastocysta. Wykorzystując morfokinetykę możliwe jest wykazanie zależności pomiędzy różnymi stadiami podziałowymi a zdolnością zarodka do wytworzenia blastocysty (Cruz, Garrido, Herrero, Perez-Cano, Munoz i Meseguer, 2012). Meseguer i wsp. przedstawili jedną z największych baz transferowanych zarodków po ICSI analizowanych systemem time-lapse, korelując poszczególne parametry morfokinetyczne ze wskaźnikami implantacji i ciąż (Meseguer, Herrero, Tejera, Hilligsoe, Ramsing i Remohi, 2011). Otrzymane wyniki zostały wykorzystane do hierarchizacji najistotniejszych parametrów w selekcji zarodków o najwyższym potencjale. Timing w zakresie podziałów do stadium 5 komórek (t5) okazał się najlepiej korelować ze wskaźnikiem implantacji. Algorytm rozpoczyna się od morfologicznej skriningowej oceny zarodków zatrzymanych w rozwoju. Następnie wyłączane były zarodki z przynajmniej jednym z następujących kryteriów wyłączenia: (i) nierówne blastomery po pierwszym podziale, (ii) zaburzony podział – bezpośrednio ze stadium jednej do trzech komórek oraz (iii) zjawisko wielojądrzastości (multinucleation) w stadium czterech blastomerów.

Po ocenie tych kryteriów pozostałe poziomy były definiowane w zależności od dokładnego timingu określonych zmiennych (t5, s2 i cc2…). Zmienne zostały odniesione do dokładnego czasu podziału do stadium 5 komórek (t5), przedziału czasowego podziału z trzech do czterech komórek (s2), trwania drugiego podziału komórkowego, przedziału czasowego pomiędzy dwiema a trzema komórkami… Wykorzystując ten algorytm i regresję logistyczną do określenia czynników predykcyjnych, przeprowadzono porównanie ze standardową morfologią, która to daje wartość pola pod krzywą AUC=0,64, podczas gdy wybór oparty na time–lapse daje wartość AUC=0,72.

Wyższa wartość AUC dla time-lapse świadczy o możliwości poprawy wyboru zarodka przy wykorzystaniu systemu ciągłego obrazowania. Wraz z powstaniem i określeniem nowych metod wyboru zarodka przy zastosowaniu time-lapse, pojawiły się wątpliwości czy zmienność warunków hodowlanych może mieć wpływ na skuteczność stosowanych algorytmów oceny oraz czy mogą one być stosowane poza ośrodkami IVF, w których dany algorytm powstał. Basile i wsp. (2013) porównali różne podłoża hodowlane wykazując identyczny timing i proporcje optymalnych zarodków hodowanych w dwóch różnych podłożach. Jednakże Ciray i wsp. (2012) przeciwnie, wykazali różnice w zakresie timingu przy zastosowaniu różnych podłoży hodowlanych (Ciray, Aksoy, Goktas, Ozturk i Bahceci, 2012). Ponadto wykazano, że stężenie tlenu wywiera silny efekt na kinetykę rozwoju przedimplatacyjnego zarodków ssaków (Kirkegaard i wsp., 2013, Wale i Gardner, 2010) i w związku z tym zarówno stężenie tlenu jak i rodzaj zastosowanego podłoża w badaniach wywiera wpływ na przebieg poszczególnych etapów rozwojowych zarodka.

Opracowany algorytm został wykorzystany później w największym retrospektywnym badaniu dotyczącym wyników ciąż. W porównaniu do konwencjonalnego systemu hodowli, wykazano 20% poprawę skuteczności w zakresie wskaźników ciąż przy wykorzystaniu systemu time-lapse (Meseguer i wsp., 2012). Wyniki te zostały potwierdzone w prospektywnym randomizowanym badaniu, gdzie podkreślono pozytywny wpływ wprowadzenia technologii time-lapse do praktyki klinicznej, co miało przełożenie na wyniki wspomaganego rozrodu (Rubio i wsp., 2014). Przedstawiona poprawa wyników klinicznych w badaniu odnosi się do lepszych warunków hodowlanych i lepszego procesu wyboru zarodka przy wykorzystaniu tak zdefiniowanego algorytmu.

Chamayou wraz z zespołem zdefiniowali dwa zestawy parametrów morfokinetycznych. Pierwszy określał optymalne zakresy wybranych parametrów, które były predykatorami zdolności zarodka do wytworzenia blastocysty w dniu piątym (czas wytworzenia przedjądrzy t1, czas podziałów na 2,4,7,8 komórek: t2, t4, t7, t8, czas utrzymywania się przedjądrzy, tC-tF i t8-t5; s3) (Chamayou i wsp., 2006). Sugerowali, że parametr cc3 jest silnie powiązany z implantacją i utworzeniem ciąży (t5-t3; cc3). Na podstawie tych wyników proponują wykonanie w trzeciej dobie transferu zarodków wybranych na podstawie algorytmu IVD-MPK (oceny rozwoju zarodków in vitro na podstawie parametrów morfokinetycznych). Analiza czasu zaniku przedjądrzy wykazała, że nie stwierdzano nigdy ciąży w przypadku, kiedy czas ich zaniku był krótszy niż 20 h i 45 min (Azzarello, Hoest i Mikkelsen, 2012), podczas gdy timing wyrzutu drugiego ciałka kierunkowego, zanik przedjądrzy i czas trwania S-fazy cyklu były powiązane ze skuteczną implantacją (Aguilar, Motato, Escriba, Ojeda, Munoz i Meseguer, 2014).

Istnieje konieczność analizy dużej ilości danych uzyskiwanych podczas oceny z zastosowaniem time-lapse. Ocena manualna jest pracochłonna i wymaga dużego przeszkolenia w tym zakresie przez użytkowników tego systemu. Ponadto czas potrzebny do analizy dużej ilości obrazów przed transferem, nawet dla wysoce wykwalifikowanego użytkownika, stanowi ograniczenie w normalnym przebiegu pracy laboratorium IVF. Istnieje także zmienność oceny pomiędzy obserwatorami, co może wpływać na interpretację wyników time-lapse, podobnie jak ma to miejsce w statycznej ocenie morfologii zarodków (Chen i wsp., 2013).

Prospektywne badania wykazały możliwość nieinwazyjnej, komputerowej, zautomatyzowanej oceny w zakresie poprawy predykcji tworzenia blastocyst i poddano ten test ocenie embriologicznej, bez jakiejkolwiek manualnej analizy (Conaghan i wsp., 2013). Test ten, nazywany Eeva (EarlyEmbryoViabilityAssessment), oparty jest na komputerowej analizie otrzymanych obrazów uzyskanych w mikroskopii z ciemnym polem widzenia i po obróbce (bazującej na czasach P2 (t3-t2) i P3 (t4-t3)) kategoryzuje grupy zarodków z dużym i małym prawdopodobieństwem utworzenia blastocyst. Połączenie Eeva z tradycyjną oceną morfologiczną zarodków w trzeciej dobie znacząco poprawia zdolność przewidzenia przez doświadczonych embriologów wytworzenia blastocyst oraz zmniejsza różnice w ocenach pomiędzy nimi (Conaghan, Chen, Willman, Ivani, Chenette, Boostanfar, Baker, Adamson, Abusief, Gvakharia, Loewke i Shen, 2013). Wyrażając zdolność predykcji w liczbach, Eeva osiąga istotnie wyższą specyficzność (84,7% vs 52,1%, p<0,0001) i pozytywną wartość predykcyjną (54,7% vs 34,5% , p<0,0001) wytworzenia blastocysty w porównaniu do samej oceny morfologii (Conaghan, Chen, Willman, Ivani, Chenette, Boostanfar, Baker, Adamson, Abusief, Gvakharia, Loewke i Shen, 2013). Następnie, model ten został zastosowany retrospektywnie w czterech różnych klinikach IVF (Kierkegaard, 2014). Mimo, że uzyskane wyniki wykazały o 30% wyższy wskaźnik implantacji pomiędzy grupą uznaną przez algorytm jako tę z wysokim potencjałem implantacyjnym, 50,6% zarodków, które dały ciążę, wg tego algorytmu było ocenione jako te z niskim wskaźnikiem implantacyjnym. Dane te podkreślają znaczenie wzrostu wskaźnika implantacji przy zastosowaniu tej aplikacji przy stosunkowo niskim odsetku wskazywanych zarodków jako tych z najwyższym potencjałem. Dalsze badania potwierdziły przypadki, gdzie słaby scoring w konwencjonalnej ocenie i/lub suboptymalna ocena morfokinetyczna kończyła się urodzeniem żywego dziecka pomimo wskazywania na wykluczenie tego zarodka z transferu (Stecher i wsp., 2014).

W większości laboratoriów IVF, transfer blastocyst wiąże się z wyższym wskaźnikiem implantacji w porównaniu do stadium wcześniejszych podziałów, ale wymaga to balansowania pomiędzy potencjalnymi negatywnymi skutkami przedłużonej hodowli, jak przerwanie cyklu z powodu nieuzyskania blastocysty, czy ewentualnym efektem epigenetycznym (Kierkegaard i wsp., 2012). Analiza transferu blastocyst w połączeniu z oceną time-lapse wskazuje na możliwość przewidzenia rozwinięcia blastocysty i implantacji (Dal Canto i wsp., 2012). Wyciągnięto wniosek, że podział pomiędzy stadium dwóch do ośmiu blastomerów występuje wcześniej w zarodkach zdolnych do wytworzenia blastocysty i implantacji.

Na bazie tych badań Kirgegaard i wsp. (2013) sugerują, że wytworzenie wysokiej jakości blastocysty można przewidzieć w ciągu pierwszych 48 godzin hodowli na podstawie krótkiego czasu trwania pierwszej cytokinezy, trwania stadium 3 komórek oraz nieobecności bezpośredniego podziału do stadium 3 blastomerów. Trwanie stadium dwóch blastomerów, zarówno w badaniu Kirgegaard oraz Cruz i wsp. (Cruz, Garrido, Herrero, Perez-Cano, Munoz i Meseguer, 2012), wykazywało różnice pomiędzy zarodkami wysokiej i niskiej jakości, w przeciwieństwie do obserwacji Wonga (Wong, Loewke, Bossert, Behr, De Jonge, Baer i Reijo Pera, 2010). Dalsze badania być może umożliwią ustalenie korelacji pomiędzy kluczowymi parametrami rozwojowymi, a scoringiem blastocysty. Istnieje jednak zastrzeżenie, że tak samo ocenione zarodki ludzkie mogą się różnić w zakresie swojej proteomiki i metabolizmu.

Istnieje wiele badań, które korelują time-lapse z prawdopodobieństwem wyboru prawidłowego chromosomalnie zarodka (Montag, 2013, Swain, 2013). Davies i wsp. (2012) zaobserwowali, że zarodki z aneuploidią mają opóźnione dwa pierwsze podziały oraz przedłużony interwał czasowy pomiędzy stadium dwóch do czterech blastomerów. Dostrzegli również nieregularność podziału i asynchroniczny zanik przedjądrzy w nieprawidłowych zarodkach. Zespół Chaveza (2012), oceniając precyzyjnie timing we wszystkich euploidalnych zarodkach do stadium czterech blastomerów stwierdził, że tylko 30% aneuploidalnych zarodków w tym badaniu zmieściło się w referencyjnych przedziałach czasowych. Campbell z zespołem utworzyli model kategoryzujący ryzyko aneuploidalności przy wykorzystaniu time-lapse. Stwierdzili oni brak różnic we wczesnych stadiach, ale zdefiniowali kolejny parametr – czas startu stadium blastulacji oraz timing wytworzenia pełnej blastocysty (Campbelli wsp., 2013).

W modelu tym wykazano znaczące różnice pomiędzy zarodkami skategoryzowanymi jako te z niskim, średnim lub wysokim ryzykiem aneuploidii w zakresie wyżej opisywanych zmiennych. Podobnie Hong i wsp. (2013) donieśli o znaczącej korelacji pomiędzy wczesnym czasem tworzenia się jamy blastocysty od stadium pierwszej cytokinezy i stadium pięciu blastomerów i mniejszej częstości aneuploidii. Basile badając różnice w zakresie czasów poszczególnych podziałów komórkowych w zarodkach prawidłowych i nieprawidłowych wyznaczył algorytm, który zwiększa prawdopodobieństwo nieinwazyjnego wyboru chromosomalnie prawidłowego zarodka. Przy zastosowaniu modelu regresji logistycznej szereg różnych zmiennych z zakresu kinetyki zarodka zostało poddane analizie wykazując największe znaczenie interwału t5-t2 oraz t5-t3 w aspekcie prawidłowego składu chromosomów (Basilei wsp., 2014). Jednak w retrospektywnym badaniu Kramer z zespołem nie byli w stanie określić przynależności zarodków do grupy euploidalnej lub aneuploidalnej bazując na ocenie parametrów morfokinetycznych (Kramer i wsp., 2014).

W związku z tym wybór zarodków w oparciu o time-lapse nie może być zastąpiony poprzez PGS (przedimplantacyjny skrining genetyczny). Basile i wsp. donoszą, że w analizie ROC, określającej morfokinetyczne parametry predykcyjne dla prawidłowego chromosomalnie zarodka, uzyskano wartość pola pod krzywą AUC=0,634 (95% CI, 0,581-0,687), co jest wartością diagnostyczną poniżej oczekiwanej nie pozwalającej przewidzieć rozwoju nieprawidłowego chromosomalnie zarodka (Basile, Nogales Mdel, Bronet, Florensa, Riqueiros, Rodrigo, Garcia-Velasco i Meseguer, 2014). Algorytm ma jednak zastosowanie w grupie dobrze rokujących pacjentów, u których nie ma wskazań do PGS lub u tych, którzy mają takie wskazania, ale z przyczyn prawnych, socjalnych, ekonomicznych nie mogą, lub nie życzą sobie przeprowadzenia PGS.

Podsumowanie opublikowanych prac dotyczących badań z zakresu time-lapse przedstawia tabela 1.

W podsumowaniu próbowaliśmy przekazać wiedzę na temat zastosowania technologii time-lapse w praktyce klinicznej. Jesteśmy świadomi, że standaryzacja nomenklatury i oceny zarodków jest konieczna i pozwala na lepszą interpretację uzyskiwanych danych oraz, że istniejące piśmiennictwo nie potwierdza jednoznacznie poprawy skuteczności w zakresie żywych urodzeń w wyniku zastosowania monitorowania time-lapse (TLM). Wskazaliśmy jednak, że istniejące badania oparte są na dużych grupach badanych i wielu ośrodkach z różnych krajów (Rubio i wsp., 2012) oraz, że aktualnie opublikowane randomizowane badanie kontrolowane (RCT) silnie umacnia pozycję time-lapse w strategii wyboru zarodka (Rubio i wsp., 2014). W końcu chcielibyśmy przedstawić stanowisko, że analiza zarodków oparta wyłącznie na konwencjonalnej ocenie morfologii pozwala tylko w średnim stopniu na predykcję zdolności zarodka do implantacji i jest ograniczone z powodu mniejszej specyficzności i swoistości. Konwencjonalna ocena wykazuje zmienność między obserwatorami i z uwagi na swoje uwarunkowania nie będzie nigdy obiektywnym ilościowym markerem rozwoju zarodka (Baxter Bendus i wsp., 2006). Należy stwierdzić, że zmienność oceny konwencjonalnej zarodków zależnej od czynników (różne podłoża hodowlane i objętości podłoży, różne ciśnienie parcjalne tlenu, metoda zapłodnienia, dzień transferu itp.) jest obecna także w większości badań dotyczących morfokinetyki, jednak nie ogranicza jej przydatności i stanowi złoty standard w embriologii od ponad ćwierćwiecza

TABELA

Piśmiennictwo

Aguilar J, Motato Y, Escriba MJ, Ojeda M, Munoz E, Meseguer M. The human first cell cycle: impact on implantation. Reproductive BioMedicine online 2014;28: 475-484.
Athayde Wirka K, Chen AA, Conaghan J, Ivani K, Gvakharia M, Behr B, Suraj V, Tan L, Shen S. Atypical embryo phenotypes identified by time-lapse microscopy: high prevalence and association with embryo development. Fertil Steril 2014.
Azzarello A, Hoest T, Mikkelsen AL. The impact of pronuclei morphology and dynamicity on live birth outcome after time-lapse culture. Human Reproduction 2012;27: 2649-2657.
Basile N, Morbeck D, Garcia-Velasco J, Bronet F, Meseguer M. Type of culture media does not affect embryo kinetics: a time-lapse analysis of sibling oocytes. Hum Reprod 2013;28: 634-641.
Basile N, Nogales Mdel C, Bronet F, Florensa M, Riqueiros M, Rodrigo L, Garcia-Velasco J, Meseguer M. Increasing the probability of selecting chromosomally normal embryos by time-lapse morphokinetics analysis. Fertil Steril 2014;101: 699-704.
Campbell A, Fishel S, Bowman N, Duffy S, Sedler M, Hickman CF. Modelling a risk classification of aneuploidy in human embryos using non-invasive morphokinetics. Reprod Biomed Online 2013;26: 477-485.
Campbell A, Fishel S, Bowman N, Duffy S, Sedler M, Thornton S. Retrospective analysis of outcomes after IVF using an aneuploidy risk model derived from time-lapse imaging without PGS. Reprod Biomed Online 2013;27: 140-146.
Chamayou S, Ragolia C, Alecci C, Storaci G, Maglia E, Russo E, Guglielmino A. Meiotic spindle presence and oocyte morphology do not predict clinical ICSI outcomes: a study of 967 transferred embryos. Reproductive BioMedicine online 2006;13: 661-667.
Chavez SL, Loewke KE, Han J, Moussavi F, Colls P, Munne S, Behr B, Reijo Pera RA. Dynamic blastomere behaviour reflects human embryo ploidy by the four-cell stage. Nature communications 2012;3: 1251.
Chen AA, Tan L, Suraj V, Reijo Pera R, Shen S. Biomarkers identified with time-lapse imaging: discovery, validation, and practical application. Fertil Steril 2013;99: 1035-1043.
Ciray HN, Aksoy T, Goktas C, Ozturk B, Bahceci M. Time-lapse evaluation of human embryo development in single versus sequential culture media--a sibling oocyte study. J Assist Reprod Genet 2012;29: 891-900.
Conaghan J, Chen AA, Willman SP, Ivani K, Chenette PE, Boostanfar R, Baker VL, Adamson GD, Abusief ME, Gvakharia M et al. Improving embryo selection using a computer-automated time-lapse image analysis test plus day 3 morphology: results from a prospective multicenter trial. Fertil Steril 2013;100: 412-419 e415.



Warning: include(footer.php): failed to open stream: No such file or directory in /home/klient.dhosting.pl/pmpcg/artnewsletter.pl/public_html/artykuly/7/5.php on line 103

Warning: include(footer.php): failed to open stream: No such file or directory in /home/klient.dhosting.pl/pmpcg/artnewsletter.pl/public_html/artykuly/7/5.php on line 103

Warning: include(): Failed opening 'footer.php' for inclusion (include_path='.:/usr/local/php/5.6/5.6.29-dh1/lib/php') in /home/klient.dhosting.pl/pmpcg/artnewsletter.pl/public_html/artykuly/7/5.php on line 103